本文由景杰学术团队报道
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蛋白质磷酸化是生物体中较常见的一种蛋白质翻译后修饰方式，它可以通过激发、调节诸多信号通路进而参与调控生物体生长、发育、逆境应激、疾病发生等多种生命过程，所以磷酸化一直是生物学研究的重点与热点。但是基于DDA分析的定量磷酸化蛋白质组学正面临着检测通量和定量稳定性等方面的突破。虽然DIA技术的发展，提供了更为稳定的定量结果，但是其应用于磷酸化等修饰组学检测一直比较困难。这一困难的核心，在于谱图解析的困难，不但需要预先建立参考库，而且在修饰位点的错误定位问题上也没有很好的解决方式。
2020年2月，哥本哈根大学Jesper Olsen在国际专业学术期刊Nature Communications报道了一种快速且稳定实现磷酸化高通量分析的方法——基于directDIA的高深度定量磷酸化蛋白质组学。在该研究中，使用directDIA方法可以不用预先建立参考库，拥有更加准确的定位信息，并且可以在15min的短梯度内鉴定超过20000个磷酸化肽段，极大提高了磷酸化检测的通量、深度和平行性。1、DDA和DIA、dDIA定量磷酸化蛋白质组学深度的比较在本文中，作者应用DDA的最佳实验方法，即15分钟LC-MS/MS梯度进行后续对比，分别鉴定出DIA洗脱组前体和磷酸肽的数量分别是DDA肽谱匹配和磷酸肽数量的三倍（图1b），且DIA显示重复之间的磷酸肽鉴定有明显更高的overlab（图1c，d），DIA的相关系数R2为0.93，而DDA的R2为0.89，也表明DIA的定量重复性更好（图1e，f），同时，量化差异也揭示出DIA测得碎片离子数比DDA高出约六倍（图1h）。图1 DDA和DIA的高通量定量磷酸化蛋白质组学检测2.DDA和DIA、dDIA定量磷酸化蛋白质组学精确度的比较为了测试复杂背景下DIA的准确定量，作者以不同比例从酵母中富集的磷酸肽稀释到HeLa磷酸肽的固定背景中，并通过DDA，dDIA和DIA对其进行了分析，且应用SAM-test的显着性d-score计算出受调节的磷酸化肽的真阳性率（TPR）和假阳性率（FPR）。与DDA相比，在所有测试比率下，DIA和dDIA都显示出最大的TPR增加。图2 DDA和DIA高通量磷酸化蛋白质组学TPR对比3．在生物环境中DDA和DIA、dDIA的技术比较作者使用不同MEK激酶抑制剂处理的EGF刺激的视网膜色素上皮细胞（RPE1）作为模型系统，不同方法总共鉴定出10,000多个磷酸肽和局部磷酸化位点的数量。同时，为了评估不同激酶抑制剂治疗对细胞磷酸化信号的生物学影响，应用方差分析（ANOVA）统计鉴定出DDA产生了474个显著调节的磷酸化位点，DIA鉴定出约两倍的调节位点（图3b）。 图3 在生物环境中DDA和不同类型DIA的技术比较在标准DIA分析期间，该算法通过对库中肽前体的所有潜在峰的检测和分类开始。只将修饰的肽作为候选位点，动态的表明所有可能的位点组合，该算法会计算并保留唯一的片段质量，然后与单个位点候选片段匹配，从而将每个片段标为确认或否定的一个特定位点候选片段（图4a） 。再结合质量精度和XIC相关性的各个碎片离子匹配，为每个候选位点计算得分后，将支持该位点的所有片段分数的和减去所有否定该位点碎片分数，来计算最终分数（图4b）。为评估PTM位点定位算法的性能，建立适当的位点可信度得分临界值以进行准确的位点定位，作者在具有已知位点定位的合成磷酸肽库中进行了测试（图4c）。结果表明，低稀释度严重阻碍了DDA鉴定磷酸化位点的数量，而DIA在所有稀释液中均保持较高的识别率，这进一步证实了DIA的灵敏度和动态范围均优于DDA，且磷酸化位点分配的错误率更低（图4d,e）。综上所述，本文主要是基于DIA对磷酸化蛋白质组学的工作流程进行改进优化，开发了PTM位点定位算法打分评估作为DIA计算的一部分，以此作为对基于DDA的最新磷酸化蛋白质组学的基准。通过分析合成磷酸肽，具有生物复制的激酶抑制剂与EGF刺激的细胞相匹配的文库，显示了基于DIA特别是dDIA的磷酸化蛋白质组的准确性，特异性和高深度。患者肿瘤的磷酸化蛋白质组学谱的分析可能更有利于未来精准医学的研究。景杰生物已经在领域内率先推出directDIA磷酸化检测服务，详情咨询当地销售或微信号后台留言。1.Dorte B. Bekker-Jensen, et al., 2020, Rapid and site-specific deep phosphoproteome profiling by data-independent acquisition without the need for spectral libraries. Nature Communications.2.Peckner, R, et al., 2018,Specter: linear deconvolution for targeted analysis of data-independent acquisition mass spectrometry proteomics. Nature Methods. 3.Searle, B. C, et al., 2019, Thesaurus: quantifying phosphopeptide positional isomers. Nature Methods.本文景杰学术团队原创解读，欢迎转发到朋友圈。如有转载、投稿、等其他合作需求，请文章下方留言，或添加微信ptm-market咨询。